1、pCMVp-NEO-BAN載體

特點(diǎn): 該真核細(xì)胞表達(dá)載體分子量為6600堿基對(duì)，主要由CMVp啟動(dòng)子、兔β-球蛋白基因內(nèi)含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架構(gòu)成， 在大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)都能高水平穩(wěn)定地表達(dá)外源目的基因。更重要的是，由于該真核細(xì)胞表達(dá)載體中抗neo基因存在，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用G418篩選，可建立穩(wěn)定的、高表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。

插入外源基因的克隆位點(diǎn)包括Sal1、BamH1和EcoR1位點(diǎn)。注意在此載體中有二個(gè)EcoR1位點(diǎn)存在。

2、pEGFP,  增強(qiáng)型絳色熒光蛋白表達(dá)載體（Enhanced Fluorecent Protein Vector）

特點(diǎn): pEGFP表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白，在PCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動(dòng)子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號(hào)組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。

用途: 該表達(dá)載體EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位點(diǎn)，將外源基因扦入這些位點(diǎn)，將合成外源基因和EGFP的融合基因。 借此可確定外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和/或組織中的定位。

亦可用于檢測(cè)克隆的啟動(dòng)子活性（取代CMV啟動(dòng)子,Acet1-Nhe1）。

3、pEGFT-Actin, 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白/人肌動(dòng)蛋白表達(dá)載體

特點(diǎn): pEGFP-Actin表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白和人胞漿β-肌動(dòng)蛋白基因，在PCMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。載體骨架中的SV40 origin使該載體在任何表達(dá)SV40 T 抗原的真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。Neo抗性盒由SV40早期啟動(dòng)子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信號(hào)組成，能應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞株。此外， 載體中的pUC origin 能保證該載體在大腸桿菌中的復(fù)制， 而位于此表達(dá)盒上游的細(xì)菌啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)kanamycin抗性基因在大腸桿菌中的表達(dá)。

用途: pEGFP-Actin載體在真核細(xì)胞表達(dá)EGFP-Actin融合蛋白，該蛋白能整合到胞內(nèi)正在生的肌動(dòng)蛋白，因而在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中觀察到細(xì)胞內(nèi)含肌動(dòng)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

4、pSV2表達(dá)載體

特點(diǎn)：該表達(dá)質(zhì)粒是以病責(zé)SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)在真核細(xì)胞目的基因進(jìn)行表達(dá)的，克隆位點(diǎn)為Hind111。SV40啟動(dòng)子具有組織/細(xì)胞的選擇特異性。此載體不含neo基因，故不能用來篩選、建立穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。

5、CMV4 表達(dá)載體

特點(diǎn):該真核細(xì)胞表達(dá)載體由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，多克隆區(qū)域酶切位點(diǎn)選擇性較多。含有氨芐青霉素抗性基因和生長(zhǎng)基因片段以及SV40復(fù)制原點(diǎn)和fl單鏈復(fù)制原點(diǎn)。但值得注意的是，該表達(dá)載體不含有neo基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后不能用G418篩選穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞株。

其他常用克隆Vector：

pBluscript II KS DNA     15 ug    

pUC18 DNA                25 ug    

pUC19 DNA                25 ug    

說明:

pBluescript II kS、pUC18 & Puc19載體適合于DN段的克隆、DNA測(cè)序和對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)等。這些載體由于在lacZ基因中含有多克隆位點(diǎn)，當(dāng)外源DN段扦入，轉(zhuǎn)化lacZ基因缺乏細(xì)胞，并在含有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，含有外源DNA載體的細(xì)胞將為白色菌落，而無(wú)外源DN段載體的細(xì)胞則為蘭色菌落，由此易于篩選有無(wú)外源DN段的載體。此外，這些載體中有便于測(cè)序的M13、T7和T3的通用引物進(jìn)行DNA測(cè)序。

保存液: TE Buffer        

TE Buffer組成:

10mM Tris.HCL（Ph 8.0）

1mM EDTA            

用途:

克隆外源DN斷.

進(jìn)行基因表達(dá).

使用M13、T7和T3引物進(jìn)行測(cè)序.

存在的問題

細(xì)胞的生命活動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程，有些生命活動(dòng)的機(jī)理還不完全清晰，由于插人的目的基因不同，載體構(gòu)建栗用的順式組件不同，組裝的空間位置不同，采用的表達(dá)系統(tǒng)不同，目的基因表達(dá)水平和陽(yáng)性克隆篩選率都會(huì)有很大差異。另外，由于所有的順式元件存在種屬和組織特異性，所構(gòu)建的高效表達(dá)載體不一定在所有細(xì)胞株中均高效表達(dá)。再者，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的差異，轉(zhuǎn)染方法的不同培養(yǎng)時(shí)閹的長(zhǎng)短，篩選藥物濃度的高低，對(duì)表達(dá)量都有很大影響。所以，需要綜合評(píng)價(jià)一個(gè)表達(dá)載體和表達(dá)系統(tǒng)，排除一些不定因素，篩選出*佳組合

真核表達(dá)載體趨向于既有利于擴(kuò)增目的基因又有利于篩選陽(yáng)性克隆的載體的構(gòu)建。許多有效的應(yīng)用范圍廣的強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子被人發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于載體中，大大提高了目的基因的表達(dá)量，另外一些強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子，如 SV40早期啟動(dòng)子+PHTLv，已應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的細(xì)胞系中。

應(yīng)用以GS為篩選標(biāo)志的表達(dá)載體可兼有篩選和擴(kuò)增目的基因兩種功能，是目前研究的重點(diǎn)。以IRES連接的雙順反子表達(dá)載體已成為核表達(dá)載體的主體。在同一啟動(dòng)子操縱下，篩選基因或報(bào)告基因與目的基因轉(zhuǎn)錄在同一mRNA上通過 IRES的作用，表達(dá)出兩種蛋白，因而在理論上可認(rèn)為，通過了篩選或表達(dá)了報(bào)告基因的克隆必為陽(yáng)性克隆，即表達(dá)目的基因的克隆，有報(bào)道說這種雙順反子的共表達(dá)率為90％。這就大大提高了篩選率，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程。

將強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可擴(kuò)增的篩選標(biāo)志組裝在同一載體上，構(gòu)建高效表達(dá)和篩選的表達(dá)載體并將其運(yùn)用于*合適的表達(dá)系統(tǒng)中，是當(dāng)今真核表達(dá)載體構(gòu)建研究發(fā)展方向。