5．接種：末次離心后加入含有1％～2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中，接種量依不同實驗?zāi)康亩ā?/div>
4） 肝細胞培養(yǎng)
初代組織塊培養(yǎng)：
取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3左右的小塊，采用帖壁培養(yǎng)法。
初代消化法培養(yǎng)：
1．把肝組織切成2～4立方毫米的小塊，用不含鈣鎂的BSS液洗兩次。
2．移入1：1的0.1％胰蛋白酶和0.1％膠原酶（都用無鈣鎂BSS配置）中，4℃冷消化10～12小時后，通過250微米和64微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過。
3．收集細胞、BSS液洗1～2次、計數(shù)、接種培養(yǎng)。
消化培養(yǎng)肝細胞的另一種方法是灌流法；肝臟灌流需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。
1．無菌解剖動物，取出肝臟，先用BSS洗除血污。
2．取5ml注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入肝管系統(tǒng)，并不時輕揉壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；消化液在肝內(nèi)停留20～30分后，在吸出消化液的同時并輕揉壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出。
3．待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)（較其它培養(yǎng)基為好），能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。
傳代培養(yǎng)：
待細胞生長連接成片后，用BSS洗一二次，加1：1的0.025％胰蛋白酶和0.02％ EDTA混合消化3～5分鐘，待細胞回縮，便停止消化，棄掉消化液，用BSS洗一二次，注入營養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液，再接種培養(yǎng)。
5）內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
1．取產(chǎn)后的新鮮臍帶。如不立即培養(yǎng)可以保存于4℃中，但不宜超過12小時。無菌剪取長10～15厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養(yǎng)。
2．先用三通注射器吸溫PBS液注入臍帶的靜脈中，洗除殘血，注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流。
3．用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入*終濃度為0.1％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化3～10分鐘。
4．吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，注入離心管中，為獲取更多細胞，可再注入溫PBS沖洗2～3次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心。
5．吸除上清，加1640培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時2～3天內(nèi)細胞即可長成單層。
6）毛細血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
腫瘤條件培養(yǎng)基制備：
1．取C3H小鼠的S-180實體肉瘤組織。
2．胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液15ml（含10％小牛血清），接種到T-75 Falcon產(chǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3．在細胞生長接近完全匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養(yǎng)基。
4．4000轉(zhuǎn)/分離心后，再通過0.22μm微孔濾膜濾過，－20℃凍存?zhèn)溆茫ㄅR用前融解）。
初代培養(yǎng)：
1．取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用Hanks液洗除血污。
2．剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成1立方毫米小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1小時，每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。
3．通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于110微米長的毛細血管小段。
4．650rpm，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶。
5．沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次。
6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打。
7．接種于鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)頭1～3小時中，毛細血管小段和內(nèi)皮細胞*先帖附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養(yǎng)液中漂浮。
8．趁此時，吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液，每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1～4個內(nèi)皮細胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細胞島，能持續(xù)2～5天。
毛細血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)：
1．初代培養(yǎng)2～3天后，鏡下確認幾個毛細血管內(nèi)皮細胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。
2．鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長（15～20分鐘），圈內(nèi)非內(nèi)皮細胞可用無菌膠刮除。
3．用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細胞。
4．剩余內(nèi)皮細胞島如小（5～20個細胞）而少時，生長增值變得緩慢或不完全不生長，此時需加入3T3等飼細胞，飼細胞接種量為4000細胞/cm2。
5．當(dāng)內(nèi)皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基。
6．接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)（飼細胞死亡淘汰），細胞增殖生長匯合后，按1：5傳代。
總訪問量：8717790 管理登錄
