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恒遠:TA克隆常見問題分析

閱讀次數(shù)：1322 發(fā)布時間：2012/9/3 9:32:51

現(xiàn)象可能原因解決方案轉(zhuǎn)化后無菌落生長感受態(tài)細胞已經(jīng)失效用pUC18質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化，確認細胞的感受態(tài)效率。1ng pUC18質(zhì)粒至少應(yīng)得到1000個以上的轉(zhuǎn)化子。如有問題，重新制備感受態(tài)細胞。平板所用抗性不對pBS-T載體為amp抗性，工作濃度 100 ug/ml 連接中使用了不恰當?shù)膙ector:ｉnsert 比例估計PCR產(chǎn)物的量，將vector:insert比例限制在3:1到 1:5的范圍內(nèi)。對于極小的PCR產(chǎn)物進行克隆，很可能因為PCR產(chǎn)物嚴重過量，導(dǎo)致無菌落或菌落極少。白色克隆無插入片段可能反復(fù)凍融導(dǎo)致載體單個的3’端突出的T已經(jīng)降解試用其他批次的T載體。長期不用的載體請在-20℃保存，避免反復(fù)凍融載體。做自連對照檢測T載體。如果自連長出大量菌落，請放棄載體。轉(zhuǎn)化后只有白色克隆本載體加T及連接PCR產(chǎn)物效率非常高，對于一些質(zhì)量很好的PCR產(chǎn)物，有可能轉(zhuǎn)化后菌落全部為白斑平板上未涂 IPTG 或X-Gal如果平板上與空白對照相比，菌落數(shù)明顯增加，則該情況很正常。絕大部分菌落為藍色或淡藍色，只有極少數(shù)的白斑有可能插入片段沒有失活lacZ基因很小的插入片段（<500bp）不一定完全將lacZ基因失活，導(dǎo)致菌斑部分藍色。如果平板長的菌落很多，而自連對照長的菌落很少，藍色菌落中就包含有插入片段。挑選一些藍色菌落提質(zhì)粒進行酶切鑒定。正常大小的藍色或白色菌落周圍有一些很小的白色菌落這些小的白色克隆為amp敏感的衛(wèi)星菌落，它們不包含質(zhì)粒。不要挑取這些很小的白色菌落。確認amp的濃度，并且平板37℃培養(yǎng)的時間不要過長。挑菌時不要挑取這些小的白色菌落。白色菌落在液體培養(yǎng)基中不長白色菌落為amp敏感的衛(wèi)星菌落確認挑選大的白色菌落，確認amp的有效性。

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